SeroKrystal™PDL微孔板在无血清条件下提升细胞活力、形态及增殖能力
作者: Ewa Wosiek,项目支持科学家 & Dr. Lindsay Parkes,高级项目科学家,Porvair Sciences Ltd.
关键词:poly-d-lysine 聚D-赖氨酸,PDL、 krystal,、serum-free 无血清、细胞培养、Sero
摘要
研究人员在无血清环境下培养细胞,以更准确地模拟生理条件。然而,在无血清条件下,许多细胞系难以附着于组织培养塑料表面,从而给细胞培养带来挑战。本应用说明展示了 Sero Krystal™ 聚-D-赖氨酸(PDL)涂层微孔板如何克服这些问题,在无血清培养基中促进细胞更好的附着、生长和增殖,特别适用于较难培养的细胞类型。
引言
细胞培养和分析技术正在快速发展,高通量筛选(HTS)的需求不断增长,特别是在药物筛选和发现等大规模应用中。近年来,多种基于细胞的 HTS 方法被用于开发潜在的抗冠状病毒治疗方案,以筛选能够抑制 SARS-CoV-2 复制的广谱抗病物。在使用贴壁细胞系的实验中,科学家通常会考虑在细胞培养基中补充胎牛血清(FBS)等动物来源的血清,以帮助细胞附着在培养器皿的塑料表面。
尽管血清有助于细胞生长,但其应用也存在诸多风险,包括污染、环境与伦理问题、成本及供应稳定性等。此外,批次间差异性也是传统培养方式的一大挑战。对于贴壁细胞而言,能够牢固地附着于培养基质表面是其增殖和分化的关键前提。Sero Krystal™ PDL 涂层微孔板为此提供了理想的解决方案,无需使用动物来源血清,即可确保细胞的附着、存活及增殖能力。
图 1. 聚赖氨酸分子结构示意图。赖氨酸是一种氨基酸,有两种对映体,即 L-赖氨酸和 D-赖氨酸
赖氨酸是一种氨基酸,存在两种对映异构体:L-赖氨酸(L-Lysine)和 D-赖氨酸(D-Lysine)。聚赖氨酸(Poly-Lysine, PL)是一种常用于组织培养器皿表面涂层的合成蛋白聚合物,能够支持贴壁细胞系的生长、附着和分化。PDL 由于带正电荷且能抵抗某些细胞分泌的蛋白酶降解,因此相比 PLL 更受青睐(Wiatrak, 2020)。此外,PDL 作为人工合成蛋白,不会影响细胞的信号通路,因此广泛应用于细胞培养系统。
Sero Krystal™ PDL 涂层微孔板提供 96 孔和 384 孔两种规格,其表面采用分子量在 70~150 kDa 之间的 PDL 聚合物进行涂层处理,使微孔板表面形成均匀的正电荷。这种正电荷表面可增强与细胞膜负电荷之间的静电相互作用(Curtis, 1983),从而提高细胞附着能力。
Sero Krystal™ PDL 微孔板特别适用于转染细胞系、原代神经元、神经胶质细胞及成纤维细胞的培养。例如粘附性小鼠成纤维细胞系L929和其他常见粘附性细胞系,包括HEK-293、BHK-21、PC12和NSC-34.
L929 细胞系是一种来源于 C3H/An 雄性小鼠皮下疏松结缔组织的成纤维细胞株(Heap, 2021)。该细胞系常被研究人员用于病毒转染及疫苗性能研究,并被视为细胞毒性测试的“金标准"(Dumitrașcu, 2022)。因此,本研究选用 L929成纤维细胞系进行试验。在选定的 PDL涂层或未涂层表面,使用无血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基(DMEM)培养 L929 细胞,并评估其形态、活性和生长情况。
实验将组织培养处理(TC)未涂层96孔聚苯乙烯(PS)表面与 Sero Krystal™ PDL 涂层微孔板的实验结果进行比较。同时,L929 细胞在这两种表面上的形态及生长数据还与以未涂层 TC 表面并补充血清培养基为对照组的数据进行比较分析。
材料与方法
L929 细胞培养
冷冻的 AATC L929 细胞(Sigma, UK)解冻后,接种于 DMEM(Lonza, Belgium)培养基中,并补充 2 mM 谷氨酰胺(Lonza, UK)、1% 青霉素/链霉素(Sigma, UK)和 10% FBS(HyClone, South America),于 37°C、5% CO₂ 环境下培养,每 48 小时传代一次。
PDL板选择
本研究使用了 Sero Krystal™ 透明 96 孔 PDL 涂层微孔板(Porvair Sciences, 英国,产品编号500269-PDL)。作为对照,选择了 Sero™ Krystal™ 未涂层透明 96 孔组织培养(TC)处理板(Porvair Sciences, 英国,产品编号500269-TC)。
铺板接种
在 75 cm²培养瓶中培养贴壁 L929细胞,使其在含有胎牛血清(FBS, HyClone, 南美)、1%青霉素/链霉素(Sigma, 英国)和 2mM 谷氨酰胺(Lonza, 英国)的培养基中生长至汇合。然后使用 0.25% 胰蛋白酶/EDTA(Sigma, 英国)进行消化。经过37°C消化 5 分钟后,细胞从培养瓶表面脱落,随后加入10 ml含10% FBS的 DMEM培养基终止胰蛋白酶消化。L929 细胞悬液转移至15 ml离心管中,以1,200 rpm离心 5分钟收集细胞沉淀。弃去上清液,并加入10 ml无血清 DMEM培养基轻柔混匀,以形成单细胞悬液。使用台盼蓝(Biorad, 英国)染色法,并借助细胞计数载玻片及TC20全自动细胞计数仪(Biorad, 英国)进行细胞计数,遵循制造商说明操作。随后,将50,000个细胞悬浮于100 µl 无血清 DMEM(Lonza, 比利时)中,该培养基补充有2mM谷氨酰胺及 1%青霉素/链霉素(Sigma, 英国),并将其接种至所选微孔板的每个孔中。细胞在37°C、5% CO₂的培养条件下孵育24小时。
形态学测试
在所选微孔板的含血清及无血清DMEM(Lonza,比利时)培养条件下孵育24小时后,使用倒置光学显微镜观察L929细胞,并使用ZOE荧光细胞成像仪(Biorad, 英国)拍摄图像,以评估细胞的形态、生长和贴壁情况。每块微孔板至少观察10个孔,以确保所得图像具有代表性。
细胞活力测试
在无血清培养基中孵育24小时后,从每块微孔板随机选取孔进行细胞计数及活力测试。细胞活力测定采用台盼蓝染色法,并使用细胞计数载玻片及 TC20 全自动细胞计数仪进行检测,具体操作与前述方法相同。在测定前,先去除选定孔中的培养基,并用100 µl预温PBS(Lonza, 英国)清洗细胞。然后使用 50 µl 0.25% 胰蛋白酶/EDTA溶液(Sigma, 英国)消化细胞,并向每个孔中加入50 µl PBS(Lonza, 英国)使总体积达到 100 µl。通过轻柔吹打使细胞形成单细胞悬液,并从12个孔中记录细胞数及细胞存活率,最终计算平均值。
结果与讨论
为了验证 Sero Krystal™ PDL 微孔板在无血清条件下促进细胞粘附、增强增殖及提高存活率的性能,我们在标准组织培养处理(TC-treated)微孔板和 Sero Krystal™ PDL 涂层微孔板上培养了 L929 细胞。
如 图 2A 所示,在无血清条件下生长的 L929 细胞在未经涂层处理的 TC 处理塑料表面上表现出细胞聚集和较差的细胞粘附性。细胞形态不规则,仅零星地附着在微孔板孔的表面,且细胞密度较低,形成了分化不良的细胞聚集体。相比之下,在Sero Krystal™ PDL 微孔板 上,细胞实现了完整融合,形态规则且分化良好。L929 细胞均匀分布在微孔板均匀涂层的孔表面(图 2B)。在 Sero Krystal™ PDL 微孔板 上,无血清条件下 L929 细胞的融合度和粘附性与在 补充血清培养基 条件下 未涂层 TC 处理塑料表面 上的细胞生长情况相当(图 2C)。这意味着 Sero Krystal™ PDL 微孔板能够避免动物血清相关的污染风险、环境及伦理问题,同时降低成本,并消除批次间差异带来的不确定性。
图 2. 在无血清 DMEM 培养基中培养的 L929 细胞生长情况:(A)TC 处理表面;(B)Porvair Sciences Sero Krystal™ PDL 涂层微孔板;(C)补充 FBS 的 DMEM 培养基中 TC 处理表面。
细胞计数及存活率测定(见 表 1)表明,在 24 小时培养后,Sero Krystal™ PDL 涂层微孔板上的 存活细胞数最高。这些数据清楚地表明,在无血清条件下,Sero Krystal™ PDL 涂层表面为贴壁生长的 L929 细胞提供了 最佳的存活环境。在 Sero Krystal™ PDL 微孔板上培养的L929 细胞,其存活率提高了 约 50%。
未涂层 TC 处理微孔板 | Sero Krystal™ PDL 微孔板 | |
总细胞数 (cell s/ ml) | 70,500 | 69,900 |
活细胞数 (cells / ml) | 37,400 | 69,900 |
细胞存活率 (%) | 53% | 100% |
表 1. 未涂层 TC 处理微孔板与 Sero Krystal™ PDL 涂层微孔板的细胞计数和细胞活力读数。
结论
本应用说明突出了光学透明 96 孔 Sero Krystal™ PDL 微孔板在无血清或低血清条件下的性能。贴壁细胞系 L929 在该微孔板上表现出增强的细胞附着性、均一的细胞形态以及加速的生长和增殖。结果表明,Sero Krystal™ PDL 涂层微孔板系列是无动物成分的理想替代方案,可在无血清环境下实现安全、高效的贴壁细胞粘附。
Sero Krystal™ PDL 微孔板提供多种孔板格式,适用于高通量筛选,同时具备不同的框架颜色,以适配各类检测系统,并通过最小化串扰提升光度检测结果。
参考
1. Curtis, A., Forrester, J., McInnes, C. and Lawrie, F., 1983. Adhesionof cells to polystyrene surfaces. Journal of Cell Biology, 97(5), pp.1500-1506.
2. Dumitrașcu, A., Caraș, I., Țucureanu, C., Ermeneanu, A. and Tofan, V., 2022. Nickel (II) and Cobalt (II) Alginate Biopolymers as a “Carryand Release" Platform for Polyhistidine-Tagged Proteins. Gels, 8(2), p.66.
3. Heap, R., Marín-Rubio,J.,Peltier, J., Heunis,T., Dannoura, A., Moore, A. and Trost, M., 2021. Proteomics characterisation of the L929 cell supernatant andits role in BMDM differentiation. Life Science Alliance, 4(6), p.e202000957.
4. Wiatrak, B., Kubis-Kubiak,
A., Piwowar, A. and Barg, E., 2020. PC12 Cell Line: Cell Types, Coating of Culture Vessels, Differentiation and Other Culture Conditions. Cells, 9(4), p.958.
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